一个分子要发光，首先要吸收光能，使电子跃迁到较高能级或激发态，当电子释放部分或全部光能时，就会发出荧光。失去的激发能是非辐射性的，失去的能量低于吸收的能量。主要的激发光与发射光谱主峰之间的差异称为stokes shift, 典型的stokes shift不超过几十纳米。

低分子量标记物

UV激发的染料：AMCA, 激发波长350nm，发射波长455nm; Alexa350与AMCA相似，但光量子得率更高。

Cascade Blue: 激发波长近390nm,发射波长约415nm，这一染料和Cascade Yellow均可被紫色激光激发。

FITC: 发射波长为520nm的荧光染料，是目前最常用的荧光标志物，它的激发波长接近488nm，光量子得率高，但受pH影响较大；Alexa488染料与FITC有同样的发射波谱，但对环境的敏感性低，是更好的染料。

CY系列染料：是花青染料的系列衍生物，包括CY2, CY3, CY5, CY5.5, CY7 等，CY染料标记的抗体易于黏附在单核细胞上，造成非特异性结合，但在粒细胞上的黏附程度低，非特异性染色少。

Alexa 系列染料：是以罗丹明为基础的系列标志物。这些染料与常用的荧光染料有类似的发射光谱，如 FITC, Texas Red, CY3, CY5, CY5.5 和 CY7. 但Alexa系列染料有更高的量子得率、更好的光稳定性和充电特性，因此，在蛋白分子上可结合更多的荧光分子，并且不结合在单核细胞上。

藻胆蛋白类染料：这些染料荧光强度高，每个荧光分子包含大量的发色团，消化系数较高，同时具有高的光量子得率，包括PE染料和APC染料。PE和APC可以分别作为供体和受体共价偶联，进行能量转移。利用PE和APC作为供体也可形成复合染料，最早的有PE-Texas Red。由于从PE到Texas Red 的能量转移不充分，导致部分发射波处于PE波谱，增大了荧光间的补偿。作为三色标记的可选染料，PE-CY5优于PE-Texas Red，从PE-Texas Red, PE-CY5, PE-CY5.5到PE-CY7能量转移的效率逐渐降低，因此弱标记的样本不适合选择PE-CY7或其他能量转移效率低的复合染料。

由APC构成的染料有APC-CY7, APC-CY5.5 等，可与APC联合标记。

PerCP染料的发射波长比较“尖锐”，因此与PE之间的干扰小，但PerCP染料在强光下容易淬灭，并且其光子常量不高，相比之下其符合染料PerCP-CY5.5更好。

复合荧光染料

复合荧光素由供体和受体两种不同的染料分子构成。像上面提到的 PE-Texas Red, PE-CY5, PE-CY5.5等。影响复合荧光素的因素包括每种染料分子的结合特性和共价键或化学键的结合效率，后者决定了供体荧光染料将能量转移到受体的效果

核酸染料

1.        染料只染核酸，不然非核酸成分，否则会产生背景荧光；

2.        选择性地染DNA或RNA, 两者都染的核酸染料用处不大；

3.        染细胞后，发出的荧光与DNA或RNA含量之间有化学计量关系；

4.        理想状态下，核酸染料与相应的核酸结合，可大幅度增强荧光信号。

荧光报告蛋白

编码荧光蛋白的基因可以与目的基因共转染，作为提供转染状态的报告分子。第一个被应用的蛋白石GFP。GFP的最佳激发波长是395nm，但在488nm可被适度有效激发，发射波长的峰值在510nm。其他荧光蛋白包括ECFP, EGFP和EYFP均由GFP基因突变产生。DsRed由珊瑚Discosoma分离得到。

Indo-1钙离子浓度探针

Indo-1是选择性钙离子螯合剂，但不会干扰细胞内钙离子的代谢。Indo-1由紫外激光（325-365nm）激发，未结合的染料发射波长约480nm，螯合钙离子的染料发射波长约为405nm。405nm与480nm荧光强度的比值指示了包内钙离子的浓度。Indo-1不能被长波长（大于370nm）激发。

量子点（Quantum dot）

半导体纳米晶体，即量子点，是非常实用的染料。小于10nm的晶体中，发射波长主要由晶体的直径决定。直径为2.1nm的CdSe晶体的发射波长为510nm，同样材料的直径为3.1nm的晶体，发射波长为560nm；晶体直径越大，发射波长越长。

量子点的激发谱宽，发射波窄并且对称。与有机染料相比，量子点不易发生漂白，光吸收能力更高。一个量子点发出的光强相当于十二个以上的荧光分子发出的光强。

如何选择合适的荧光染料

（1）确定荧光染料本身所适合的流式细胞仪，需要了解染料的激发波长和发射波长、仪器所配制的检测滤光片和激发光源。

（2）了解荧光素的相对荧光强度：相对荧光强度反映的是荧光素-单抗结合物的亮度，其判断标准是染色指数。影响相对荧光强度的因素包括：不同仪器的激光及滤片组合不同，荧光素的相对荧光强度不同；抗体上荧光素分子的多少会影响相对的荧光强度。

（3）选择原则：考虑抗原的密度【高密度表达的抗原可考虑选择几乎所有的荧光素；低密度表达的抗原需要可提供较高S/N比值的荧光素，如PE/APC。】；自发荧光【每种细胞群都有不同水平的自发荧光，所有的荧光通道均可观察的自发荧光，但自发荧光强度在波长较长时迅速降低。对自发荧光较强的细胞，选择发射波长长的荧光素（APC）可得到较好的S/N比值，对于自发荧光强度弱的细胞，发射波长长的荧光素对S/N提高没有明显的改善，可选用FITC。】；非特异性结合；复合染料【避免信号衰退。复合染料因为光、固定剂或温度升高会导致信号衰退，使复合染料在上一级染料处发光。减少样本暴露于光、高温或固定剂，可很大程度上避免这一问题。若样本需要固定，要选择稳定的固定剂，可有效阻止复合染料的信号衰退。尽量减少信号间的干扰，检测的颜色越多，面临的信号干扰越多，选择试剂时尽可能降低荧光发射波长间的重叠。】。

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