免疫组化的定义和原理以及分类、优势等这里就不再做介绍了，相信大家都知道了，这里我们就讲讲容易出现的一些小问题，但却往往决定着成败，遗憾的是我检索了比较多的资料，都没有详细的提及这些问题。

       对于刚刚入门的科研小白来讲，免疫组化的步骤是较为繁琐，只要一步错了，就会步步错，有时候明明觉得都是按照老师提供的条件和方法做的，可惜就是得不到预期得结果，那一定是某个环节出现了问题，今天我们就来总结下有那有哪些是最常见的八大问题。

一、取材与制片

        一定要按照标本的标本留取要求留取，比如某个组织在固定前要求用湿润的生理盐水纱布，如果用干的纱布则会大大影响实验效果，导致第一步就错了，直接输在起了跑线上。

       制片的厚度和均一度同样很重要，如果每张片子的厚度不同，则实验时所需的条件就会有差异，然而我们又不可能随意的调整实验的反应时间，大多数读研读博的医院都是研究型大学的附属医院，建议把这个交给大病理科完成制片，像某些科室有亚专科，由于成立时间相对较短，制片水平不如大病理科。

二、反应温度

        大多数建议在常规 4 ℃下进行，背景浅，反应温和，不足之处是长须过夜。也有些试剂推荐 37 ℃，反应较快，最不建议做的就是室温，因为波动较大，如果非得在室温下做，比如 25 ℃，建议使用水浴恒温箱。

三、取抗体

        比如以抗体 1:1 000 稀释为例，枪头吸取 0.5 ul，首先这个很难观察到底取了多少，误差太大，如果不小心枪头外周沾了一抗很难察觉的到，所以建议梯度稀释法较妥，在不影响实验也可换别的试剂，比如 1:50 稀释，在误差不可避免的情况下把影响降到最低。

四、滴加相应试剂

      最简单的方式是将所有玻片同时浸入泡缸内，但是由于试剂昂贵，此法基本行不通。大多数采用移液枪滴加的方法，但这又带来了新的问题，假设有 10 张玻片，每滴加一张所需时间为 20～30 s，从第一张到最后一张时间相差近 5 分钟，如果最后一张滴加完在开始计时，假设反应时间为 5 分钟，那么第一张片子实际反应时间为 10 分钟，而只有第 10 张玻片反应时间为 5 分钟。此问题在单人操作中尤其明显，需要操作者准确地把握时间。当然假设你的反应时间需要很长，如为 12 小时，那么 5 分钟就可以忽略，没有什么影响了。

五、平整放置玻片

        玻片反应是一定要放置平整的，要不然液体流动导致反应时有部分组织干片，无法着色或染色时出现非特异性着色。

六、染色时间

        一张成功的免疫组化片子一定是轻松染色的，不用通过增加染色的时间来提高成功率，比如用藻红蛋白进行染色时，他就有他的时间规定，相反一味延长染色时间容易导致非特异性着色。

七、擦拭玻片

        PBS 浸泡后，不要想把组织上的液体彻底擦拭干净，因为这样更容易导致干片，尽量甩干，但组织周围的液体一定擦拭干净，这样滴加上去的液体由于表面张力不易流动。

八、所有操作中均要遵循的原则：不能干片

        所有试验步骤操作方法均不难，难的是出现了问题如何取解决，由于整个流程中关键的步骤就那么 3～4 步，但是一旦出现问题，由于排列组合的原因，会出现多种组合，变得异常繁琐。所以一定要多思考。

这就是科研小白在免疫组化过程中常见的八大问题，希望对大家有用。