随着流式细胞术应用领域的日益广泛，流式抗体及荧光标记产品的种类、数量也在不断增多，加上多色分析实验方案需求的增长，逐渐产生了抗体难选择、荧光难搭配等问题，给实验顺利开展带来了诸多困扰。流式抗体如何选择，也成为了流式技术是否能被成功应用的关键因素之一。

       流式抗体如何选择，主要可以从以下六个方面进行：

抗体选择的基本条件：

1 目标蛋白特异性：确定目的细胞的特异性表面标记或者胞内标记，知道您要检测什么；

2 严格按照样本种属来源进行选择，流式抗体基本无法进行种属交叉反应；

3 可用于流式实验，说明书中明确标注经FC实验测试，最好有实验数据图和用量说明；

4 抗体克隆号一般不需要关注，有特殊需要的情况下可以参考文献上提到的克隆；同一抗体多个克隆号的情况下，可以选择荧光标记种类最多的那个克隆。

确定流式细胞仪的参数配置：

1 有几个激发光？一般的流式细胞仪有488nm和635nm两个激发器，但有些机器只装了一个激发器，需要注意，型号相同的机器未必激光配置相同；

2 有几个滤光片？这决定了你最多可以同时检测几个指标；

3 仪器的型号？有助于再次确定检测通道，因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测，有时候检测的通道也是不一样的。

流式抗体的选择：

1 流式抗体本身也是抗体，所以选择流式抗体一定要满足抗体选择最基本的条件：目标蛋白特异性，反应种属以及应用实验。

2 流式抗体荧光标记的方式包括直接标记和间接标记两种。在流式实验过程中，尽量减少实验工序和过程，以保证实验的真实和准确性。因此在条件允许的范围内，建议尽量用直接标记的抗体进行实验而不去做间接标记。

3 流式抗体荧光标记的选择：如果实验中检测单一指标：不同荧光标记在不同的仪器上强度不同。FACS Calibur仪器为例：PE ＞APC ＞PE-Cy5 ＞PerCP ＞FITC ＞PerCP-Cy5.5，通常来说，PE最强，适用于弱表达抗原。FITC强度较弱，适用于强表达抗原，使用范围比较广。用户需根据检测的目标蛋白进行具体选择。如果同时检测多个指标：确认流式细胞仪能检测多少个通道：流式抗体每个通道只能选择1种荧光素。各个通道之间的荧光素可以随意搭配。

如：实验者同时检测三个指标，可以在图1中绿色、黄色和红色三个通道中各选一个适当的荧光素标记，FITC、PE和PE-cy5。切忌所有指标选择同一个通道的荧光标记，以防止荧光的重叠和相互干扰，影响最后结果。因此，流式细胞仪的通道越多，同一份样本能同时做的表面/胞内标志就越多。常用荧光标记包括FITC, PE, PEcy5, PEcy5.5, APC等。

同型对照的选择：

流式细胞实验和其他抗体相关实验有点不同的就是需要选择同型对照。同型对照，是用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色，相当于实验的阴性对照。同型对照选择与标记抗体同种属来源，同亚型，同荧光标记的抗体。比如：抗人的CD3的PE标记的抗体，小鼠的IgG2a。同型对照选择PE标记的小鼠的IgG2a。

流式抗体使用注意事项：

1 建议实验细胞的数量和抗体的比例要适当。细胞过量或抗体过量都可能使实验结果受影响，因此需要优化试验条件。注：不同的流式技术对抗体的需求量有较大差异，例如传统流式细胞术 （采用鞘液流系统）需要1×106个细胞为起始上样量，抗体用量为10μl，而微流式细胞术 则只需5×105个细胞，抗体用量减少到5μl。

2 直标的流式抗体应该4℃避光保存，不要冷冻。

3 尽量选择经实验验证的流式抗体，以保证实验结果。默克密理博公司Milli-Mark系列流式抗体已经通过了实验验证，并且提供了相关数据图供用户参考。

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